PENDAHULUAN
Metode ini hanya untuk sampel daun tanaman. Untuk beberapa tanaman terutama yang mengandung senyawa fenolik tinggi harus berasal dari daun kecambah setelah kotiledon. Bahan ekstraksi dan dilusi merupakan bahan kit dari Sigma-Aldrich. Modifikasi dilakukan dengan melakukan presipitasi dengan etanol absolute dan pencucian dengan campuran chloroform isoamylalkohol.
Beberapa defenisi yang perlu diketahui adalah :
- DNA merupakan molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme dan tersusun atas gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida.
- Ekstraksi adalah proses pemisahan suatu penyusun yang diinginkan dari penyusun lainnya dalam suatu massa.
- Kit merupakan suatu bahan siap pakai hasil pabrikasi.
ALAT DAN BAHAN
Alat yang digunakan antara lain adalah :
- Gunting
- Water Bath / hot plate
- Pelampung Mikrotube
- Micropipet 1000 mikroliter
- Rak tip dan rak mikrotube
- Centrifuge
- Freezer
- Vacum pump
- Vortex mixer
Bahan yang digunakan antara lain :
- Extraction solution dan dilution solution dari Kit Sigma
- Etanol Absolute.
- Campuran Cloroform dan lsoamylalkohol (24:1)
- Air double distilate
- Microtube 2 ml
- Tip mikropipet 1000 mikro liter
CARA KERJA
- Perlu diingat untuk menggunakan alat dan bahan yang steril.
- Siapkan larutan ekstrak dari Kit Sigma sebanyak 100 mikro liter pada mikrotube 2 ml.
- Cuci gunting yang akan digunakan dengan arkohol 70% kemudian keringkan dengan tissue yang baru.
- Masukan potongan daun pada mikrotube (daun harus dalam keadaan terendam).
- Panaskan pada suhu 95 C menggunakan waterbath selama 5 menit.
- Tambahkan larutan dilusi sebanyak 100 mikroliter.
- Tambahkan aquades sebanyak 300 mikroliter.
- Pindahkan cairan pada mikrotube 1500 mikroliter (usahakan sisa daun tidak terbawa).
- Tambahkan campuran cloroform isoamylalkohol (CIA 24:1) sebanyak 150 mikroliter. Aduk dengan vortex mixer selama +/- 10 detik.
- Centrifuge pada kecepatan 15.000 rpm atau +/- 12.000 G
- Pindahkan supernatan pada mikrotube 1500 mikroliter.
- Tambahkan etanol absolut 2 kali volume supernatan.
- Jika suspensi/gumpalan lendir tidak terlihat, dapat dimasukkan ke dalam freezer selama 10 menit.
- Centrifuge pada kecepatan 7000 rpm (+/- 5000 G).
- Buang larutan etanol lalu keringkan diatas kertas tissue.
- Jika alkohol sudah tidak ada yang menetes, keringkan DNA dengan vacum pump sampai kering.
- Larutkan paket DNA dengan air double destilate.
Sumber : Instruksi Kerja Metode Ekstraksi DNA Laboratorium Plant Molecular Biology Dep. Agronomi dan Hortikultura IPB.
0 Response to "Metode Ekstraksi DNA Tanaman"
Posting Komentar